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日用化工产品通常引起刺激性皮炎、色素沉着和变态反应性皮炎等皮肤疾病,在化妆品所引起的病例中占到了95%以上。因此,皮肤刺激/腐蚀试验是化妆品总体*评价程序的一部分,特别是对于可能引起皮肤刺激或腐蚀作用的化妆品特殊组份,进行皮肤刺激/腐蚀试验十分必要。**都把化妆品及其原料的皮肤刺激/腐蚀试验列为化妆品*评价的检测内容。
一、化妆品的局部皮肤毒性反应
皮肤暴露于外源物质(包括化学品、药物或化妆品)可引起多种皮肤反应,反应早期通常是因皮肤屏障功能破坏而出现的皮肤干燥(水分失丢),然后形成红斑和水肿为特征的皮肤刺激反应;还有一部分是由于过敏导致的接触过敏和色素沉着。据报道,职业因素和化妆品引起的皮肤病中接触性皮炎约占90%以上,其中全部接触性皮炎病例中约70%为皮肤刺激性反应。临床上引起两种不同类型的炎症反应过程:刺激性和变态反应性皮炎。通常皮肤接触化学物质后,可观察和辨别到几种非*性的反应形式:
皮肤刺激性是指皮肤接触受试物后产生的局部可逆性损伤,皮肤刺激反应一般无*系统的参与,其典型表现是红斑或水肿。皮肤腐蚀性指的是不可逆损伤,典型表现是溃疡、出血和血痂,以及由于皮肤漂白出现的脱色、脱发和疤痕。国际法规强制要求化学品上市前必须进行皮肤腐蚀性评价。但是腐蚀性并不是化妆品使用中希望发生的现象,只是由于制造商失误或消费者误用的情况下偶然发生的情况。另一方面,化妆品原料也可能本身具有腐蚀性,但在化妆品中并不排斥使用,因此终产品腐蚀性的大小与下列因素密切相关:化妆品中腐蚀物质的终浓度、中和物质的有无、赋形剂的使用、暴露途径以及使用条件等。
累积性刺激是重复暴露于外源物质发生的可逆刺激反应,接触此类物质引起的皮肤变化较缓慢,如皮肤增厚、皱纹产生和色素沉着等,这些变化是皮肤炎症的间接效应。
二、体内动物实验
传统皮肤刺激和腐蚀试验多采用动物进行。单次体内皮肤刺激试验一般用兔进行,每次试验至少选择4只健康的成年动物。如预期有刺激反应,初试应考虑使用1只动物。如没有出现明显的阳性反应(红斑或水肿记分大于2)时,应至少再使用2只动物进行试验。如预期无反应,初试可使用3只动物。在使用了至少3只动物后,如仍为疑似反应或不明确,应考虑进行复试。
多次体内皮肤刺激试验是指在7~14天内对实验动物进行重复皮肤染毒,对检测化妆品刺激性的效果比单次染毒效果好,特别适用于与皮肤长期密切接触的或反复使用的个人护理产品。每次试验选择三组以上的动物,每组动物雌雄各5~10只,各组分别接受不同剂量的受试物进行测试。根据产品的性质和用途,多次皮肤刺激试验进行染毒程序、方式和次数的调整。
三、体内人体皮肤刺激试验
人体皮肤贴斑试验包括单次、多次和加强暴露刺激试验等多种,其目的是检测受试物引起人体不良反应的可能性。人体试验一般是用来决定产品或配方的“皮肤相对兼容性”和进行局部“暴露”的风险评价,以证明这种物质应用于化妆品中**次接触人皮肤或粘膜时对人体无损害。然而,如果只是为了危害评估,化妆品人体志愿者测试获得的数据存在一些特定的偶然性。
单次刺激斑贴试验是评价化妆品对皮肤刺激性的经典方法之一,通常采用芬兰斑试器(Finn chamber)或不同直径的Hilltop斑试器。实验方法有局部全封闭斑贴法和局部半封闭斑贴法,区别在于前者完全不透气,后者使用半封闭敷料固定,接触时间通常为24~48h。可根据实际情况进行调整。
四、已认可的皮肤刺激试验体外方法
经过近20年的皮肤刺激试验体外替代方法的研究,目前,经过验证和认可的体外方法主要是人工皮肤模型法,该方法于2010年经OECD认可为指南439。
1、EpiSkin模型试验
EpiSkin是一种三维人体皮肤模型,由法国里昂的EPISKIN-SNC公司开发。用于替代皮肤刺激试验时,直接将测试物质局部应用于皮肤表面,然后用MTT法评价测试物对细胞活性的作用,以百分比细胞活性为检测终点用于区分皮肤刺激物和非刺激物。商品化的皮肤刺激检测试剂盒含培养基、试剂和12个表皮单位,表皮单位由具有屏障功能的重建表皮组成。可以检测所有剂型的化学物质,包括粉剂、液体、分散剂等。将受试化妆品(10uL,mg)涂抹于人工皮肤表面,作用30min后,去除受试物,继续孵育42小时,用MTT法测试细胞存活率,必要时辅以IL-1α测定。判断标准:与对照组相比细胞活性>50%表明受试物无刺激性,细胞活性≤50%,表明受试物具有刺激性。
2、EpiDermTM模型试验
EpiDerm重建皮肤模型,由位于美国马里兰州阿什兰德的MatTek公司研发并生产。EpiDerm皮肤模型由来源于人皮肤的角质细胞生长于特殊制备的Millicell细胞嵌入培养板中,形成多层分化的人类表皮模型,模型由基底层、棘层、颗粒层和角化层组成,与体内皮肤结构类似。以EPI-200为例,试剂盒含24块人工皮肤组织,培养10天的人工皮肤以特殊制备的嵌入板为支持物,嵌入板包埋于含营养液的琼脂糖凝胶中便于运输,试剂盒还包括维持培养基和MTT检测成分。早期的判定方案是通过测定ET550值(接触化合物后使组织活性下降50%所需的暴露时间),通过与阳性对照相比来评估评估化合物的刺激性和非刺激性。后来,采纳了与EpiSkin类似的方案,即与阴性对照组相比,细胞活性TM模型试验
3、CORROSITEXTM皮肤腐蚀试验
CORROSITEX试验体系由人造的大分子生物膜和检测系统(CDS)两部分组成。蛋白大分子水凝胶生物膜模拟皮肤的正常功能,假定腐蚀性物质作用于生物膜与作用于活体皮肤的机制相似,将受试物作用于人工膜屏障的表面,检测由腐蚀性受试物引起的膜屏障损伤。通过多种方法检测膜屏障的渗透性,包括pH指示剂颜色的改变和指示剂溶液其它特性的改变。受试物开始作用于膜屏障到膜屏障渗透改变之间经过的时间(以min计)作为受试物腐蚀性分类和UN化学品包装分类(如果适用)的依据。对每一个试验方法,都有三种腐蚀性分类的截止时间值。根据截止时间对受试物腐蚀性的判定应当使腐蚀性危害较小化,即减少假阴性结果的出现。Corrositex较早由美国运输部认可用于危害化学物分类,ICCVAM认可其对酸、碱衍生物,以及以其为主要成份的配方的检测。该方法已经过验证,并被推荐为评估化学品皮肤腐蚀性危害分级测试策略的一部分。
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